Der Landkreis Main-Spessart liegt in der westlichen Mitte des bayerischen Regierungsbezirks Unterfranken. Nachbarkreise sind im Norden der hessische Main-Kinzig-Kreis, im Osten die Landkreise Bad Kissingen und Schweinfurt, im Süden der baden-württembergische Main-Tauber-Kreis und der Landkreis Würzburg sowie im Westen die Landkreise Miltenberg und Aschaffenburg.
Das Kreisgebiet wird vom Main und dem Spessart geprägt. Der Main erreicht von Würzburg kommend im Südosten das Kreisgebiet. Er fließt zunächst in nordwestlicher Richtung, vorbei an der Kreisstadt Karlstadt nach Gemünden, der sog. Dreiflüssestadt. Hier nimmt er die von Nordosten und Norden kommenden Flüsse Fränkische Saale und die Sinn auf, die sich kurz vor der Mündung vereinigt haben. Nach wenigen Kilometern wendet sich der Main nach Südwesten und erreicht auf seinem weiteren Lauf die Städte Lohr und von hier südwärts Marktheidenfeld. Einige Kilometer südlich von Marktheidenfeld bildet der Main die Landesgrenze zu Baden-Württemberg. Die letzte Landkreisgemeinde am Lauf des Maines ist die Marktgemeinde Kreuzwertheim. Hier fließt der Main westwärts in Richtung Miltenberg. Weitere Flüsse im Kreisgebiet – neben dem Main, der Fränkischen Saale und der Sinn – sind die Wern, die kurz vor Gemünden in den Main mündet, sowie der bei Lohr einmündende gleichnamige Fluss Lohr und die Hafenlohr, die bei der gleichnamigen Gemeinde Hafenlohr in den Main fließt.
Westlich des Mains ziehen sich die Höhen des Spessarts bis auf über 500 m hinauf. Der höchste Erhebung im Spessart ist der 586 m hohe Geiersberg mit der Sendeanlage Breitsol bei Rohrbrunn, er gehört seit 2009 zur Gemarkung der Landkreisgemeinde Bischbrunn. Die Hermannskoppe mit 567 m im Norden des Kreisgebietes, bildet die Grenze von Bayern und Hessen. Im Nordosten liegen die Ausläufer der Rhön – Einertsberg 486 m – im Kreisgebiet.